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==免疫组化 ==

在本研究中，新的组织切片由FFPE块制成，并进行了免疫组织化学（IHC）标记。从每个块进行连续切片，用不同的抗体标记，以减少切片之间的变异性。使用切片机以 4 μm 厚度切片组织，并安装在聚赖氨酸包被的 SuperFrost TM Plus 载玻片上（Thermo Fisher Scientific，奥斯陆，挪威）。所有洗涤步骤均使用2次磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行，每次5分钟，所有孵育均在室温下旋转台上的湿润室中进行。组织切片在二甲苯中脱蜡，并使用自动载玻片染色机上的标准方案通过乙醇梯度再水化。使用 Diva Decloaked（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）在 110oC 的压力锅中进行热诱导表位修复 10 分钟。使用防水液体阻滞笔（PAP Pen，Dako，Glostrup，丹麦）包围组织。使用过氧化物1（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）抑制内源性过氧化物酶活性10分钟。使用背景狙击手（Biocare Medical，Histolab，哥德堡，瑞典）封锁了这些部分 10 分钟。然后将切片与在达芬奇稀释绿液（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）中稀释的一抗一起孵育 30 分钟。CD204（小鼠抗人类，克隆SRA-E5，Abnova）以1：100稀释度施用，CD206（兔抗人类，多克隆，Abcam）以1：800稀释度施用。6,27,56 切片用 Mach 1 小鼠探针（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）孵育 CD204 15 分钟，用 Mach 1 通用探针（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）孵育 CD206 30 分钟。然后将切片与 3-氨基-9-乙基咔唑 （AEC） 底物显色剂（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）一起孵育 10 分钟，然后用 Meyer 苏木精复染 10 秒。使用水溶性封固介质（Aquatex，Merck，Darmstadt，Germany®）安装组织切片，并晾干过夜。每个组织样本都用 CD204 和 CD206 抗体染色。阴性对照通过省略一抗进行处理。同型对照被标记为方案优化的一部分，以确保组织没有非特异性标记。使用相同的方案标记来自每个组织（脾脏、心脏、肺、腹膜、肝脏、肾脏和肌肉）的样本，同时在相同稀释度下用物种特异性同种型对照（小鼠 IgG 和兔 IgG 同种型对照，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，奥斯陆，挪威）替换一抗。没有病理学发现的尸检对照犬的脾组织切片被用作阳性对照。

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