犬内脏血管肉瘤中的肿瘤相关巨噬细胞

原文：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37341055/ 全文：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10687809/

Published: 2024

1 Abstract

犬血管肉瘤（HSA）是一种来源于造血干细胞的高度恶性肿瘤，常见于内脏器官或皮肤。尽管进行了多模式治疗，但内脏 HSA 具有特别的侵袭性，并且进展迅速。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在人类和小鼠模型的致癌、肿瘤进展和转移中起着核心作用。在这项回顾性研究中，我们调查了患有自然发生 HSA 的私人拥有的、未接受过治疗的狗中 TAM 的患病率和表型。我们使用 CD204 作为一般巨噬细胞标志物，使用 CD206 作为 M2 极化巨噬细胞的标志物。对 17 只狗的脾脏（n = 9）、心脏（n = 6）和其他位置（n = 12）的 HSA 的福尔马林固定石蜡包埋组织进行切片，并用 CD204 和 CD206 抗体进行免疫组织化学标记。比较对数（CD204）和对数（CD206）阳性细胞的平均数以及对数（CD206/CD204）阳性细胞的比例与正常周围组织和肿瘤位置之间的比率。肿瘤热点（P = .0002、P < 0.0001 和 P = 0.0002）和热点外的肿瘤组织（分别为 P = .009、P = 0.002 和 P = 0.007）的巨噬细胞和 M2 巨噬细胞明显多，M2 巨噬细胞与总巨噬细胞的比率高于正常周围组织。肿瘤位置之间没有显着差异，但脾肿瘤内CD204阳性巨噬细胞的数量有增加的趋势。组织学参数或临床分期与TAM数量或表型之间没有关联。与人类一样，患有 HSA 的狗的 TAM 主要具有 M2 偏斜的表型。患有HSA的狗可以作为评估新的TAM重编程疗法的优秀模型。

2 Introduction

犬血管肉瘤（HSA）是一种高度恶性肿瘤，传统上认为来源于内皮细胞，但现在认为起源于造血干细胞.17,29,52 HSA 可以在身体的任何部位发展，但最常发生在脾脏、心脏、肝脏和皮肤.8,16,18,49 内脏 HSA 通常与早期和广泛的转移有关.8，12,25,46,49 狗经常出现突然发作的临床症状，由体腔出血引起，例如腹膜或心包腔。尽管进行了根治性手术治疗，但患有内脏 HSA 的狗会迅速发展为转移性疾病，中位生存时间（MST）为 4-8 周.8,46,60 然而，在 2 项基于人群的研究中，使用基于人类分类方案的新组织学和免疫组织化学分类系统评估了挪威犬癌症登记处的犬血管肿瘤，发现血管内皮瘤和 HSA 之间的总生存期差异很大，特别是当它们位于脾脏时.12,15,16血管内皮瘤的侵袭性远低于低分化的HSA。为了开发分级系统，Ogilvie 等人发现核多形性和有丝分裂评分与完全切除肿瘤后狗的无病间隔（DFI）和存活时间（ST）独立相关。43 分级和其他组织学参数与 DFI 或 ST 没有显着相关性。额外的强化辅助化疗延长了患有 HSA 的狗的 ST，但 MST 仍然很差（4-6 个月）[2,4,60] 节拍化疗对生存产生了与传统化疗相似的影响，但将它们结合起来并不能进一步提高生存率[1,33] 1995 年， Vail 等人表明，与单独接受手术治疗的狗相比，免疫刺激药物胞壁酰二肽 （MDP）显着改善了脾脏 HSA 狗的 MST[57]。后来发现 MDP 激活巨噬细胞中含有细胞内核苷酸结合寡聚结构域的蛋白 2 （NOD2）受体，导致促炎白细胞介素的产生[42]。这些白细胞介素将巨噬细胞重编程为 M1 极化并导致抗肿瘤活性[13]。

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在人类和小鼠模型的癌症的几个方面起着核心作用。23 在体外，巨噬细胞分别响应促炎或抗炎信号，经历经典或替代极化为 M1 和 M2 巨噬细胞。36 个 M1 巨噬细胞与促炎 Th1 反应相关，而 M2 与抗炎 Th2 反应相关。M1 巨噬细胞具有大量促炎白细胞介素、共刺激分子和趋化因子，可诱导抗原特异性细胞毒性 CD8 T 细胞反应和对发炎组织的趋化性。另一方面，44 M2 巨噬细胞产生对组织修复至关重要的抗炎白细胞介素、血管生成因子和基质重塑酶。10 然而，这种 M1/M2 二分法并不能完全反映巨噬细胞极化和可塑性的复杂性.34,40 在人类和小鼠中，TAM 可以表现出 M1 和 M2 相关特征，但由于其表型和功能特征，通常被认为更偏向 M2.23,62。

TAMs在肿瘤微环境（TME）和转移性生态位中起着核心作用，并且在两者中都大量存在.23,62 TAMs可以促进肿瘤侵袭，内渗，肿瘤细胞在循环中的存活和肿瘤细胞的外渗.3,19,47它们还通过诱导遗传不稳定性，重塑细胞外基质，促进血管生成和抑制适应性免疫反应来促进肿瘤进展.23。62 肿瘤组织中 TAM 的数量在几种人类癌症中具有独立的预后价值，数量越大通常与较差的结果相关。然而，在狗中，很少有研究描述了 TAM、M2 标志物和巨噬细胞极化.5,14,21,22,45,50,59 报告表明，较高数量的浸润性 TAM 与患有乳腺肿瘤的狗的整体 ST 较差相关.50,51 在患有 HSA 的狗的转移性病变中，肿瘤组织中存在的单核细胞数量高于其他肿瘤。48

表型巨噬细胞标志物不一定可以从一个物种转移到另一个物种，应该针对每个物种进行验证.41,55 甘露糖受体CD206在体外犬M2巨噬细胞上高度表达，但对其在体内的表达知之甚少。21 Monteiro 等人表明，恶性犬乳腺肿瘤中几乎所有浸润的巨噬细胞都是 CD206 阳性，这进一步支持了 TAM 在狗中呈 M2 偏斜并在肿瘤微环境中起核心作用的观点。38 清道夫受体 CD204 已被证明是犬巨噬细胞的良好标志物，在正常条件下与树突状细胞或未分化的血液单核细胞没有交叉反应27,56。

尽管对犬内脏 HSA 进行了多模式治疗，但由于预后不佳，迫切需要新的治疗策略。旨在使TAM复极化的免疫疗法可能代表了这种新策略。然而，没有关于患有 HSA 的狗的 TAM 表型的公开数据。我们的研究旨在调查私人拥有的未接受治疗的狗的内脏 HSA 中 CD204-（巨噬细胞）和 CD206（M2 偏斜巨噬细胞）阳性细胞的数量。我们想研究肿瘤内 M2 巨噬细胞与周围组织以及不同肿瘤位置之间的患病率，以评估它们是否更丰富地存在于肿瘤组织中。

3 Materials and Methods

3.1 研究人群和样本收集

回顾性收集了 2018 年 1 月至 2021 年 12 月期间对私人拥有的、未接受过治疗的患有自然发生的内脏 HSA 的狗进行的所有尸检病例的组织样本，有或没有播散性疾病，回顾性地从挪威生命科学大学临床前科学和病理学系的病理学档案中收集。从病历中获得相应的临床元数据（品种、年龄、性别、药物和合并症）。需要主人的书面同意才能将狗纳入研究。如果狗接受过 HSA 的手术治疗、有隐匿性特应性或过敏性疾病病史、既往或并发肿瘤疾病、目前正在服用免疫调节药物（糖皮质激素或细胞毒性药物）或患有全身炎症性疾病（感染性或免疫介导）。

3.2 尸检

该研究包括17只狗（表1）。所有病例均由兽医病理学家进行了标准的尸检。每只狗都有详细的病理记录，包括所有主要器官系统的完整宏观和组织学描述以及任何异常发现。收集标准器官样本和来自所有肿瘤的样本并固定在 10% 缓冲福尔马林、石蜡包埋中，并在室温下以福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）块的形式储存。共有27个肿瘤样本，其中13个为原发肿瘤，14个为转移瘤。7例（41.2%）HSA位于1个器官，10例（58.8%）肿瘤位于2个或更多部位。由于并不总是能够确定哪个肿瘤代表原发肿瘤，因此将肿瘤分为脾脏、心脏和其他部位。

3.3 分期和组织学参数

苏木精和伊红染色切片由委员会认证的兽医病理学家审查，以确认组织病理学诊断并评估肿瘤的组织学参数。根据 Ogilvie 等人使用的分级系统对组织学参数进行评分 43 简而言之，总体分化评分为 1 到 3，其中 3 分化程度最低，核多形性从 0 到 3,3 分标记为核多形性，坏死量从 0 到 3（在石蜡包埋前修剪肉眼可见的坏死区域后进行组织学评估），其中 3 个坏死率超过 50%，有丝分裂数量从 0 到 3，其中 3 个表示每 10 个高功率场（HPF）有丝分裂超过 30 个（400 倍，相当于总面积 2.37 mm2）。计算总分，0-5 分为 1,6-9 分为 2 级，10-12 分为 3 级。根据先前建立的分期方案，回顾性地使用尸检报告为每个病例分配从I到III的临床分期（表2）。58

4 免疫组化

在本研究中，新的组织切片由FFPE块制成，并进行了免疫组织化学（IHC）标记。从每个块进行连续切片，用不同的抗体标记，以减少切片之间的变异性。使用切片机以 4 μm 厚度切片组织，并安装在聚赖氨酸包被的 SuperFrost TM Plus 载玻片上（Thermo Fisher Scientific，奥斯陆，挪威）。所有洗涤步骤均使用2次磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行，每次5分钟，所有孵育均在室温下旋转台上的湿润室中进行。组织切片在二甲苯中脱蜡，并使用自动载玻片染色机上的标准方案通过乙醇梯度再水化。使用 Diva Decloaked（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）在 110oC 的压力锅中进行热诱导表位修复 10 分钟。使用防水液体阻滞笔（PAP Pen，Dako，Glostrup，丹麦）包围组织。使用过氧化物1（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）抑制内源性过氧化物酶活性10分钟。使用背景狙击手（Biocare Medical，Histolab，哥德堡，瑞典）封锁了这些部分 10 分钟。然后将切片与在达芬奇稀释绿液（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）中稀释的一抗一起孵育 30 分钟。CD204（小鼠抗人类，克隆SRA-E5，Abnova）以1：100稀释度施用，CD206（兔抗人类，多克隆，Abcam）以1：800稀释度施用。6,27,56 切片用 Mach 1 小鼠探针（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）孵育 CD204 15 分钟，用 Mach 1 通用探针（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）孵育 CD206 30 分钟。然后将切片与 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物显色剂（Biocare Medical，Histolab，Gothenburg，Sweden）一起孵育 10 分钟，然后用 Meyer 苏木精复染 10 秒。使用水溶性封固介质（Aquatex，Merck，Darmstadt，Germany®）安装组织切片，并晾干过夜。每个组织样本都用 CD204 和 CD206 抗体染色。阴性对照通过省略一抗进行处理。同型对照被标记为方案优化的一部分，以确保组织没有非特异性标记。使用相同的方案标记来自每个组织（脾脏、心脏、肺、腹膜、肝脏、肾脏和肌肉）的样本，同时在相同稀释度下用物种特异性同种型对照（小鼠 IgG 和兔 IgG 同种型对照，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，奥斯陆，挪威）替换一抗。没有病理学发现的尸检对照犬的脾组织切片被用作阳性对照。

5 免疫组化分析和定量

所有载玻片均使用蔡司AX10显微镜手动扫描，该显微镜配备蔡司axiocam 506彩色相机，并配有Zen pro 2012（蓝色版）图像采集软件（Carl Zeiss Microscopy GmbH，耶拿，德国）。显示弱免疫标记或没有免疫标记的部分被排除在分析之外。组织折叠或脱落的区域也被排除在外。当存在时，避免了坏死和出血的区域。在肿瘤组织（n = 27）中，CD204和CD206阳性细胞在阳性细胞密度最高的区域（称为热点）和热点外均被计数。热点由调查人员主观确定。在热点内随机选择的 5 个 HPF 中计数细胞，在热点外的肿瘤组织和肿瘤周围的正常组织中类似地计数细胞，并报告为每个 HPF 的平均数。HPF的面积为0.078 mm2。如果肿瘤周围没有正常组织，则仅对肿瘤内的阳性细胞进行计数。使用 CD206-/CD204 阳性细胞的比率估计 CD206 阳性巨噬细胞的比例。

6 统计分析

所有统计分析均使用JMP pro 16.1.0（SAS Institute Inc.，Cary，NC）进行。CD204 和 CD206 阳性细胞的数量以及 CD206/CD204 阳性细胞的比率在拟合到混合模型之前，使用 JMP 中的模型构建函数进行对数转换。为了比较不同计数区域之间的这些数字，将肿瘤位置和计数区域设置为固定因子，而将病例数和组织样本数设置为随机因子。在评估肿瘤位置之间的差异时，将肿瘤位置设置为固定因子，将病例数和组织样本数设置为随机因子，并单独评估肿瘤内的计数区域。在评估组织学参数评分对计数数据的影响时，将有丝分裂评分、有丝分裂计数、坏死评分、核多形性评分和分化评分作为固定因素，而病例数和组织样本数作为随机因素，并单独评估肿瘤内的计数区域。在评估临床分期效果时，将分期设置为固定因子，将病例数和组织样本数设置为随机因子，并单独评估肿瘤内的计数区域。当使用图形方法（通过预测图和残差的正态分位图进行残差）进行评估时，所有模型都满足使用混合模型的条件（独立性、方差的均匀性、线性和残差的正态性）。Tukey 检验用于比较 2 组以上时不同固定因子之间的差异。对于统计检验，< .05 的 P 值被认为具有统计学意义。

7 结果

7.1 临床特征和肿瘤样本

平均年龄为9.7岁（范围：6-13岁）。公狗10只（58.8%），母狗7只（41.2%）。7只（41.2%）狗被归类为II期，10只（58.8%）狗被归类为III期疾病。12 个（70.6%）肿瘤被分级为 1 级，5 个（29.4%）被分级为 2 级。没有一个肿瘤被归类为3级。在 8 个肿瘤样本中，没有足够的周围正常组织来量化肿瘤组织外的阳性细胞。2 只狗（1 只来自脾肿瘤，1 只来自肝转移）各有一个肿瘤样本，有广泛的坏死，因此无法量化免疫标记的细胞。这些肿瘤被排除在分析之外，而这些狗的其余肿瘤则被包括在内。

7.2 肿瘤组织和正常周围组织中CD204和CD206阳性细胞的定量

组织驻留巨噬细胞和肿瘤浸润巨噬细胞对CD204具有强烈的免疫标记（图1a，，2a，2a，，3a，3a，，4a）。有CD204阳性细胞密度高的区域，在肿瘤内形成热点（图1c，，2c，2c，，3c，3c，，4c），4c），但在周围组织中没有。肿瘤热点内和热点外肿瘤的平均对数（CD204）显著高于正常周围组织（P = .0002和P = .009）（图5a）。肿瘤热点和热点外肿瘤的平均对数（CD204）无显著差异（P=.43）。

同样，肿瘤浸润巨噬细胞对CD206进行了强烈免疫标记（图1d，，2d，2d，，3d，3d，，4d）。周围正常组织中的组织驻留巨噬细胞具有更多可变的免疫标记，具体取决于器官[图1b，，2b，2b，，3b，3b，，4b）.4b）。肺部的间质和肺泡巨噬细胞大多为CD206阳性，肾皮质中的间质巨噬细胞也是如此。另一方面，脾红髓中只有极小比例的巨噬细胞是CD206阳性的。同样，肝脏中的 Kupffer 细胞是 CD206 阴性的，很少有间质巨噬细胞或血管内单核细胞在肝脏中显示阳性标记。心脏间质巨噬细胞也大多为CD206阴性。肿瘤热点内和热点外肿瘤的平均对数（CD206）显著高于正常周围组织（P < .0001和P = .002）（图5b）。此外，肿瘤热点内的平均log（CD206）显著高于热点外肿瘤（P = .001）。肿瘤热点内和热点外肿瘤的平均对数（CD206/CD204）也显著高于正常周围组织（分别为P = .0002和P = .007）（图5c）。肿瘤热点和热点外肿瘤的平均对数（CD206/CD204）无显著差异（P=.45）。

7.3 肿瘤位置之间CD204和CD206阳性细胞的比较

肿瘤部位（脾脏、心脏或其他部位）之间的平均对数（CD204）在肿瘤热点（P = .59）（图 6a）或热点（P = .70）外的肿瘤组织中没有显着差异（图 7a）。同样，不同肿瘤部位之间的热点（图6b）或热点外肿瘤组织（图7b）的平均对数（CD206）没有显著差异（P = .46和P = .46）。热点（P = .94）（图6c）或热点外肿瘤组织（P = .14）（图7c）中不同肿瘤位置的平均对数（CD206/CD204）无显著差异。

7.4 不同分期肿瘤CD204阳性和CD206阳性细胞的比较及组织学参数评分

多形性评分为0的肿瘤中，肿瘤热点的平均log（CD204）显著高于评分为1或2的肿瘤（P=.01和P=.02）。然而，热点外肿瘤组织的平均对数（CD204）在具有不同多形性评分的肿瘤之间没有显着差异（P = .39）。肿瘤热点和热点外肿瘤组织的平均log（CD204）在不同有丝分裂评分（P = .06和P = .45）、坏死评分（P = .10和P = .70）、分化评分（P = .06 和 P = .34）之间没有显着差异，也没有显示出与有丝分裂计数的任何相关性（P = .10 和 P = .64）。肿瘤热点和热点外肿瘤组织的平均对数（CD206）在有丝分裂评分（P = .85 和 P = .25）、坏死评分（P = .81 和 P = .34）、核多形性（P = .28 和 P = .19）或分化评分（P = .45 和 P = .70）之间没有显着差异，或与有丝分裂计数相关（P = .37 和 P = .19）。同样，肿瘤热点和热点外肿瘤组织的平均对数（CD206/CD204）在有丝分裂评分（P = .27和P = .65）、坏死评分（P = .47和P = .65）、核多形性（P = .16 和 P = .90）、分化评分（P = .44 和 P = .50）或与有丝分裂计数相关（P = .61 和 P = .72）之间没有显着差异。

不同临床分期肿瘤肿瘤热点的平均对数（CD204）、平均对数（CD206）和平均对数（CD206/CD204）均无显著差异（P=.40、P=.77和P=.70）。同样，在不同临床阶段，热点以外的肿瘤组织的平均对数（CD204）、平均对数（CD206）或平均对数（CD206/CD204）没有显著差异（分别为P=.26、P=.88和P=.70）。

8 讨论

我们发现，CD206-/CD204阳性细胞在肿瘤热点内和热点外的肿瘤组织中的平均比例显著高于周围正常组织。因此，肿瘤组织内的 M2 偏斜巨噬细胞多于肿瘤组织外，表明肿瘤内存在活跃的促肿瘤极化。我们的结果与人类和小鼠肿瘤中报道的结果一致，表明TAM靶向疗法可能代表了犬HSA的可行治疗选择23,62。

在这项研究中，肿瘤热点内和热点外的肿瘤组织中的CD204和CD206阳性细胞比正常周围组织（脾脏、心脏、肝脏、肾脏和肺）多。这一发现支持了这样一种观点，即要么存在分化为巨噬细胞的循环单核细胞的主动募集，要么局部组织驻留的巨噬细胞响应 HSA 的生长而扩增。在肺癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤的小鼠模型中，TAMs起源于扩张的组织驻留巨噬细胞和循环单核细胞.11,30,63 Regan等人表明，犬HSA细胞分泌高水平的趋化因子CCL2，刺激单核细胞迁移和募集到转移。48然而，他们没有探索募集的单核细胞对TAM总数的相对贡献，也不能根据我们的结果来确定。

我们发现肿瘤部位之间每HPF（0.078mm2）的CD204阳性或CD206阳性细胞数量没有显着差异，CD206/CD204阳性细胞的比例也没有显着差异。脾脏肿瘤中每个HPF的CD204阳性细胞数量高于心脏和其他器官的肿瘤，但并不显著。了解脾脏或心脏病变是否代表患有 HSA 的狗的原发性肿瘤可能具有挑战性，尤其是在回顾性研究设计中。因此，我们将病变分为心脏、脾脏和其他部位。事实上，在脾脏病变中，每个HPF的CD204阳性细胞数量较高，这是最常报告的原发性肿瘤部位，与转移相比，可能对应于原发肿瘤内TAM的数量更高.4,8鉴于狗的数量很少，该研究可能不足以显示任何此类差异。在一项比较透明细胞肾细胞癌患者中配对原发性和转移性肿瘤样本之间表型差异的研究中报告了类似的结果。39 原发性肿瘤中CD204阳性细胞的数量似乎高于转移瘤。他们还观察到，与转移瘤相比，原发性肿瘤中CD163（人类M2相关标志物）阳性巨噬细胞的比例更高。有趣的是，另一种巨噬细胞标志物离子化钙结合接头分子1（IBA1）阳性细胞的数量显示出相反的模式。另一方面，Withers等人表明，肺转移中CD204阳性巨噬细胞的数量明显高于骨肉瘤狗的原发性肿瘤。61 原发性和转移性病变之间 TAM 数量的这些差异是否是由于肿瘤类型或研究器官之间的生物学差异，仍有待探索。

由于我们的目的是研究未接受过治疗的狗在不同肿瘤部位的巨噬细胞表型，因此我们无法将我们的发现与临床结果联系起来。大多数化学疗法，包括用于治疗患有HSA的狗的化学疗法，都会影响TAM的数量及其表型.9,20,32化学疗法通常会将TAM转向促炎，抗肿瘤M1表型，这可能会改变我们的研究结果。此外，与手术相关的急性应激会影响巨噬细胞表型和 TAM 浸润.26,35,54 手术已被证明会增加原发肿瘤和转移瘤内 TAM 的数量，并使转移靶器官中的 TAM 和巨噬细胞偏向促肿瘤 M2 表型.26,35,54

当将临床分期和组织学参数与 TAM 数和表型进行比较时，核多形性是唯一显示显着相关性的评分。较高的多形性评分与较少的CD204阳性细胞数量相关。然而，只有 2 只患有肿瘤的狗的多形性评分为 0，这使得这一发现的有效性受到质疑。几项研究表明，较高的 TAM 数量与几种人类癌症的不良临床结果相关。62 兽医领域也出现了类似的发现，较高的 TAM 数量与较差的 ST 或较高的组织学等级相关.14,45,50,59 我们的研究结果是否反映了 TAM 数量与患有 HSA 的狗的组织学参数之间几乎没有关联的事实，或者我们的研究是否动力不足尚不清楚。由于大多数 HSA 具有相似的生物学行为，转移广泛且生存率低，因此肿瘤之间的 TAM 数量和表型可能没有任何差异25,46,49。

在过去的十年中，在癌症治疗中靶向TAMs引起了人们的极大兴趣.28,53已经提出了几种策略，包括（1）TAM的消耗，（2）抑制血液单核细胞的募集，或（3）TAM的重编程。基于抑制TAMs募集和耗竭的试验结果令人失望，因此重点似乎正在转向重编程。7 药物 MDP 是最早用于狗的免疫疗法之一.31,57 与单独手术治疗的狗相比，MDP 对患有骨肉瘤和 HSA 的狗具有显着的临床益处。MDP 与巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和潘氏细胞的细胞内 NOD2 受体结合.24,42 NOD2 结合导致核因子 κB （NF-κB）通路的激活和促炎细胞因子的下游产生，例如肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-8 和 IL-12。这些细胞因子通常与 M1 倾斜的巨噬细胞和改善的杀瘤能力有关。MDP 的临床益处让我们希望，更具选择性的 TAM 靶向免疫疗法可能会在未来提高患有 HSA 的狗的生存率。57

CD206 在各种器官的正常组织驻留巨噬细胞中的表达以前没有在狗身上进行过研究。在肝脏、脾脏和心脏肿瘤周围的正常组织中，组织驻留的巨噬细胞大部分是CD206阴性的。肺中的大多数肺泡和间质巨噬细胞是CD206阳性的。在没有癌症的健康狗中是否也是如此，或者是转移前生态位形成的影响仍未探索。在人类中，健康个体的大多数肺泡巨噬细胞似乎是CD206阳性的，这与我们的发现非常吻合。37 我们还观察到肾皮层中组织驻留的巨噬细胞是 CD206 阳性，但只有 1 只狗有肾转移。

我们的研究有几个可能的局限性。首先，我们没有将来自非癌症患者的组织样本作为对照组，尽管我们将来自同一只狗的健康周围组织作为内部对照。健康周围组织中巨噬细胞的数量和表型可能受到肿瘤的影响，并且在健康狗的生理条件下可能会有所不同。其次，该研究是回顾性的，纳入病例的代表性可以提高。在数据收集过程中还存在遗漏相关临床和组织病理学数据的风险。第三，纳入的狗数量很少，并且存在遗漏不同位置之间 HSA 病变中巨噬细胞数量和表型差异的风险。最后，在单独的载玻片上进行 CD204 和 CD206 免疫组化，而不是使用多重 IHC/免疫荧光等方法，在估计双阳性细胞时会引入一些误差。尽管对连续切片进行染色应导致有限的变异，但无法计算完全相同的区域。

总之，我们已经表明，肿瘤组织中表达 CD206 的 M2 极化巨噬细胞的数量明显高于正常周围组织。这与人类医学的发现一致，并支持TAM具有免疫抑制和促肿瘤作用的观点。我们发现与肿瘤位置相关的巨噬细胞数量或表型没有显着差异。临床分期或组织学参数与 TAM 的数量或表型之间没有关联，除了较高的核多形性评分与较低的 TAM 数量相关。鉴于患有癌症的狗的转化价值，患有HSA的狗可以作为评估旨在重新编程TAM的新疗法的良好模型。

9 References

狗狗心包积液